Друга информация
Съдържание:
I. Литературен обзор 6
1. Същност на мутациите 6
2. Видове мутации в прокариоти 8
3. Репарационни механизми 12
3.1. Обратна поправка 13
3.2. Базови ексцизионни репарации 13
3.3. Нуклеотид-ексцизионна репарация 15
3.4. Пострепликационна поправка, зависеща от метилационния статус 16
4. CRISPR интерференция потискане на генната експресия в прокариоти 18
4.1. Принцип на CRISPR интерференция 18
4.2. Механизъм на CRISPR интерференция 18
5. MutS и dnaQ - основни гени отговорни за точноста на репликацията в E.coli 19
5.1. Гени отговорни за точноста на ДНК полимеразите – dnaQ (MutD) 19
5.2. Гени участващи в системата за mismatch поправка 20
6. Същност и значение на мутаторните щамове E.coli 22
7. Приложения на мутаторни щамове 22
II. Цели и задачи 24
1. Цел 24
2. Задачи 24
III. Материали и методи 25
1. Бактериални щамове, среди и условия на култивиране, плазмидни вектори 25
1.1. Бактериални щамове 25
1.2. Среди и условия на култивиране 25
1.3. Използвани плазмидни вектори 25
2. Използвани праймери 26
3. Процедура за дизайн на водещи РНКи 27
4. Изолиране на плазмидна ДНК 27
5. Електрофоретични методи 28
6. PCR техники за проверка на генни конструкти 28
7. In silico симулации на молекулно клониране и дизайн на праймери 29
8. Техники за молекулно клониране 30
8.1. Получаване на компетентни клетки 30
8.2. Получаване на компетентни клетки с Cas9 30
8.3. Получаване на компетентни клетки с Jun lab tunable CRISPRi 30
8.4. Трансформация на компетентни клетки E.coli 30
8.5. Залагане на рестрикционни реакции 31
8.6. Залагане на лигазна реакция 31
8.7. Клониране на нови водещи РНК-и в pSB1K3-gRNA 32
9. Изследване на бройката спонтанни мутации в E.coli 32
IV. Резултати и обсъждане 33
1. In silico дизайн на водещи РНК-и, за подтискане експресията на гени в E.coli 33
2. Клониране на избраните водещи РНК във вектор pSB1K3-gRNA. 36
3. Доказване на функционалната активност на клонираните водещи РНК-и 37
4. Тест на системата Jun lab tunable CRISPRi щам – pSB1K3-gRNA 38
5. Сглобяване на няколко касети за експресия на водеща РНК в един вектор 39
6. Влияние на CRISPRi върху мутационните нива в E.coli 41
7. Заключение 43
V. Изводи и приноси 44
1. Изводи 44
2. Приноси 44
VI. Използвана литература 45