Друга информация
СЪДЪРЖАНИЕ

1. Увод ........................................................................................................................... 5
2. Литературен обзор ....................................................................................... 7
2.1. Рак на белите дробове. Класификация .......................................... 7
2.1.1. Етиология .................................................................................................... 7
2.1.2. Хистологична класификация ........................................................... 8
2.1.3. Лечение ......................................................................................................... 9
2.2. Репарация на молекулата на ДНК ...................................................... 10
2.2.1. Базово ексцизионна репарация ....................................................... 11
2.2.2. Премахване на погрешно включени нуклеотиди в молекулата на ДНК .................................................................................................... 12
2.2.3. Нуклеотид - ексцизионна репарация ........................................... 13
2.2.4. Съществуват две системи, използващи рекомбинация, за да поправят двойноверижни разкъсвания в молекулата на ДНК ........ 15
2.2.5. Нехомоложно свързване на краищата ......................................... 16
2.2.6. Поправка на молекулата на ДНК чрез хомоложна рекомбинация ............................................................................................................... 17
2.3. Роля на PARP1 и PARP2 протеините в поправката
на ДНК ........................................................................................................................ 22
2.4. Роля на RAD51 в поправката на ДНК ................................................ 25
2.5. Синтетична леталност .............................................................................. 26
2.6. Блеомицин – структура и механизъм нa действие ................... 28
2.6.1. Структура на блеомицина ................................................................... 28
2.6.2. ДНК като вътреклетъчна мишена за блеомицина ................ 32
2.6.3. Селективна цитотоксичност към туморни клетки ............. 32
2.6.4. Поправка на едноверижни скъсвания предизвикани от блеомицин ...................................................................................................................... 33
2.6.5. Поправка на двойноверижни скъсвания предизвикани от блеомицин ...................................................................................................................... 35
2.6.6.Транспорт на блеомицина .................................................................. 36
2.7. Малки интерфериращи РНКи (siRNA - small interfering RNA) – характеристика и механизъм на действие ............................................... 36
2.7.1. Структура на siRNA ................................................................................ 37
2.7.2. Механизъм на действие на siRNA .................................................. 38
3. Цел и задачи .......................................................................................................... 39
3.1. Цел ....................................................................................................................... 39
3.2. Задачи ................................................................................................................ 39
4. Материали и методи ..................................................................................... 39
4.1. Материали ....................................................................................................... 39
4.2. Използвани реактиви ............................................................................... 40
4.3. Методи ............................................................................................................... 42
4.3.1. Пасаж на клетъчна линия A549 ....................................................... 42
4.3.2. Определяне на оптималната работна концентрация на блеомицин чрез Clonogenic Assay ...................................................................... 42
4.3.3. Определяне на преживяемостта на клетъчна линия A549, след третиране с 1uM блеомицин в присъствието на Olaparib и BO2, чрез Clonogenic Assay ................................................................................................. 44
4.3.4. Подготовка за имунооцветяване .................................................... 46
4.3.5. Имунооцветяване .................................................................................... 48
4.3.6. Изолиране на тотален белтък за Western blot ........................ 49
4.3.7. Определяне на количеството изолиран белтък ................... 50
4.3.8. Провеждане на Western blot ............................................................. 50
4.3.9. Изолиране на РНК .................................................................................. 53
4.3.11. Обратна транскрипция ..................................................................... 53
4.3.12. qPCR ............................................................................................................. 54
4.3.13. Трансфекция ........................................................................................... 55
5. Резултати и дискусия .................................................................................. 58
5.1. Определяне на работната концентрация на беломицин .... 58
5.2. Използване на беломицин в комбинация с
Olaparib и BO2 ................................................................................................................ 58
5.3. Проверка на нивата на Поли-АДФ-рибозилирането (pADPr) и формирането на огнища от RAD51, чрез имунооцветяване ........... 60
5.4. Използване на siRNAs като инхибитори на PARP1/2 и RAD51 в присъствието и отсъствието на беломицин ........................................... 67
5.5. Определяне на преживяемостта на клетъчна линия A549 в присъствието на siRNAs срещу RAD51, PARP1 и PARP2 в комбинация с блеомицин ................................................................................................................... 78
6. Изводи ...................................................................................................................... 80
7. Изпозлвана литература .............................................................................. 81